11. 6. 2021

    V minulém díle jsme pojednávali o AOBS a použití různých laserů v systému STELLARIS. V předchozích dílech jsme představili nové detektory, ale nezabývali jsme se principem a průřezem různých technologií pro detektory.  V tomto díle se budeme těmto technologiím věnovat a představíme si novinku Leica STELLARIS TauSENSE v podobě tauGating, tauContrast a tauSeparation.

Není detektor jako detektor

     Začneme u nejjednoduššího a nejznámější typ detektoru používaného u běžných konvenčních konfokálních systémů je PMT (Photomultiplier Tubes) viz obr.1. Je znám již od počátku 30. let [1]. Je založen na fotoelektrickém jevu, který poprvé popsal H. Hertz [2] a interpretoval A. Einstein [3]. Fotokatoda je obvykle vrstva alkalických atomů, která uvolní elektrony po absorpci fotonů na tuto vrstu. Fotokatoda je obvykle vystavena záření fotonů, které se detekují jako signal. Účinnost takových fotokatod je okolo 30% QE (kvantová účinnost = kolik fotonů dopadne v poměru generovaných elektronů). Přiložené napětí umožňuje zrychlit fotoelektron na první dynodu, kde se uvolňují sekundární elektrony. Zisk na dynodách je obvykle omezen na méně než pětinásobek, kvůli vlastnostem materiálu dynod. Elektrický impuls generovaný jedinou dynodou nelze odlišit od elektrického šumu. Aby se dosáhlo dostatečného zisku, jsou sekundární elektrony urychlovány na další dynodu atd. [4]. Slabé signály s vyšším gain (vyšší napětí pro urychlení) jsou s velkým šumem na pozadí.

Obr.1.png

Obr. 1 - Trubice fotonásobiče (PMT): Foton (hν) zasáhne fotokatodu, kde se uvolní fotoelektron (e-). Počet elektronů (modré tečky) se vynásobí na každé dynodě a konečný elektronový mrak se odečte na anodě.

GaAsP (PMT) detektor  už není to nejlepší

     Díky vývoji materiálů lze poměr QE zlepšit použitím katody pro PMT detektor s vrstvou galium arsenid (GaAsP) až na QE okolo 45%, což přinese zlepšení při slabších signálech. Co ale onen zmiňovaný šum pro takový typ detektoru? Správně si odpovídáte ano, nic se nemění, čím více zvyšujete gain, tím více šumu generujete. Často si klademe, jakou vlastně hodnotu gain nastavit, jak kvantifikovat apod. Jak toto vyřešit?

     Lavinová fotodioda APD (Avalanche Photodiodes) přináší velké zlepšení z pohledu šumu. Upravená PIN dioda, doplněná multiplikační vrstvou obr. 02. Pokud je foton absorbován ve vnitřní vrstvě, vygeneruje nábojový pár (vnitřní fotoelektrický efekt), náboj je poté zrychlen aplikovaným napětím. Silné elektrické pole v multiplikační zóně (p-n, na obr. 02) způsobuje zesílení uvolněním mnoha (až přibližně 1000) dalších nábojů. Výstupní signál je úměrný počtu absorbovaných fotonů, proto lze zařízení v určitém rozsahu intenzity použít jako světelný senzor.

Obr.2.png

Obr. 2 - Lavinová fotodioda (APD): absorpce fotonu ve vnitřní (i) zóně způsobí oddělení náboje, náboj je dale distribuován do multiplikační zóny (pn), kde se dosahuje vyšších zisků.

GaAsP vrstva a APD = Leica Power HyD

     Hlavním omezením PMT je nízký zisk v každém kroku násobení a generování šumu. Hlavním omezením APD je rozsah činnosti: pouze velmi nízké intenzity. Hybridní kombinace obou technologií nabízí řešení, které naštěstí ukazuje výhody obou. Tato kombinace vakuové a polovodičové technologie byla původně vyvinuta pro experimenty ve fyzice částic [5]. Leica Microsystems vyvinula tento nový typ detektoru pro konfokální systémy. Princip je zobrazen na obr. 3, kdy se generuje signál na vysoce citlivé vrstvě GaAsP či SiliconBased a vyráží se elektrony, které jsou urychlené na část APD detektoru. Obrovská výhoda je minimalizaci výsledného šumu a rychlosti detekce jednotlivých příchozích fotonů. Neunikne Vám už jediný foton!

Obr%C3%A1zek3.png

Obr. 3.  Princip HyD detektoru a srovnání rychlosti detekce jednotlivých signálů

Nová řada Power HyD S, X, R detektory

     Další velmi důležitým parametrem je zisk signálu pro jednotlivé detektory v celé spektrální oblasti, resp. kde je jaký detektor vhodné použít. U nové řady detektorů Leica Power HyD S je tento rozsah opravdu obrovský. Celé spektrum pro použití je zobrazeno na obr. 4. Další HyD X a HyD R je dedikovaný pro FLIM, FCS, FLIM-FRET experimenty se systémem STELLARIS8 FALCON. Poslední z řady Power HyD R je s vyšším ziskem v červené oblasti. Všechny detektory jsou přizpůsobené pro snímání až do oblasti do 850nm! Jaký vybrat? HyD S je opravdu dobrá volba pro rutinní snímání, HyD X a HyD R jsou doporučené pro FLIM, FCS experimenty a HyD R navíc až do 850nm.

Obr%C3%A1zek4.png

Obr. 4.  Spektrální rozsah jednotlivých detektorů

     Další vlastností tohoto detektoru je možnost přepnutí z analogového modu do digitálního pro velmi silné signály, použití pro reflexi apod. viz obr. 5.

Obr%C3%A1zek5.png

Obr. 5.  Ukázka různých modu pro Power HyD S detektor

Nová technologie STELLARIS TauSense

     Do současnosti většina systémů měřila pouze intenzitu fluorescence. Nová technologie s názvem STELLARIS TauSENSE Vám dává potenciál přidat novou informaci, nejenom o intenzitě, ale především době příchodu fotonu (lifetime). Informaci o době života zpracovává do metadat ke každému snímku. Vhodné to je především proto, kdy jsi nejste jistí cross-talkem, autofluorescencí, artefaktům apod. Ve zkratce tato technologie odkryje všechny nepřesnosti, které můžou při snímání nastat. STELLARIS TauSENSE obsahuje několik možností separace jako například TauContrast, TauGating, TauScan a TauSeparation, které si rozebereme. 

     Začneme s první zmíněnou technologií TauContrast. Kontrast je detekován pro každý pixel   průměrnou dobou příchodu (AAT) fotonů detekovaných během doby prodlevy pixelu (pixel dwell time). Snímky ukazují savčí buňku značenou téměř infračervenou membránovou barvou. Šipky označují vezikuly s různými hodnotami pH (červená, modrá, zelená). Na obr. 6 je obrázek intenzity: bodové vezikuly vykazují vyšší intenzitu než okolní cytoplazma. Obrázek TauContrast: s tabulkou (LUT) barevné překrytí odpovídá AAT (0-1 ns); změny vezikulárního pH během internalizace jsou patrnější než na obrázku intenzity, s měřítkem 20 μm. 

Obr%C3%A1zek6.png

Obr. 6.  STELLARIS TauSENSE a jednotlivé módy TauContrast

     Díky této metodě získáte přístup k fyziologickým informacím s parametry, jako jsou změny pH, teploty a koncentrace iontů. Kromě zachycení informací o intenzitě fluorescence pro každý pixel obsahuje podrobnosti o průměrných dobách příchodu fotonu (lifetime), která se může měnit v závislosti na posunech v mikroprostředí. Pomocí TauContrast lze takové změny mapovat a vizualizovat. Například rozdíly v hodnotách pH, intracelulární vezikuly nejsou podle intenzity fluorescence patrné. S TauContrast jsou tyto rozdíly odhaleny, protože lifetime jednotlivých fluoroforů se liší v závislosti na lokálním pH.

     Další možností je a technologií je TauGating, který lze použít k odstranění nežádoucího signálu opět na základě liftime jednotlivých fotonů. Například snímky intenzity bazální membrány v živých buňkách často obsahují reflexi, která může maskovat důležitý signál. Odražené fotony mají kratší lifetime ve srovnání s fluorescenčním signálem a proto lze rozlišit a odseparovat signály pomocí funkce TauGating. Na obr. 7 je uveden příklad pro TauGating, který oddělue nežádoucí signál od endogenního pigmentu (purpurová, krátké ATs) spočítáním fotonů přicházejících během vybraného časového úseku. Získáme tak čistý sledovaný signál (azurová, dlouhá ATs) Stupnice: 200 μm. (Ukázka obrázku se svolením: Julien Vermot, IGBMC, Štrasburk). Vzorek zebrafish z řady 4xGTIIC: d2GFP, která stále obsahuje jejich nativní pigmenty. Signál GFP poskytuje odečet aktivity Yap1 / Taz-Tead a zde se používá k vizualizaci pruhového svalu trupu.

Obr%C3%A1zek7.png

Obr. 7  - STELLARIS TauGating

     Poslední novou technologií jsou TauScan a TauSeparation, využívájí lifetime pro oddělení fluoroforů, které nelze spektrálně oddělit pomocí zmíněných dvou předchozích technologií. Využitím rozdílů v časech příchodu jednotlivých fotonů a signálů od LifeAct-GFP a MitoTracker Green (purpurová) lze jasně oddělit jednotlivé fluorofory, přestože se výrazně spektrálně překrývají. Tato technologie významně rozšiřuje potenciální počet a kombinace fluoroforů, které lze použít v jednom experimentu. Na obr. 8 je uveden TauScan a TauSeparation. TauScan a TauSeparation buněk savců exprimujících LifeAct-GFP (vyráběný společností ibidi GmbH) a označené zelenou mitochondriální skvrnou. Schéma ukazuje distribuci komponent po celou dobu životnosti s měřítkem 10 μm. Také jsou vidět časové vyhodnocení doby života (lifetime) v kombinaci s počtem fotonů.

Obr%C3%A1zek8.png

Obr. 8 - STELLARIS TauScan a TauSeparation

STELLARIS Vám otevírá nové možnosti

     STELLARIS přináší nový rozměr pro konfokální mikroskopii a poskytuje výrazně víc informací než současné konvenční konfokální systémy.  S kontrasty TauSENSE a pouhými několika kliknutími můžete odstranit nechtěný signál a odhalit více detailů ve svých snímcích, multiplexovat více fluorescenčních barviv v jednom experimentu a oddělit fluorofory, které mají překrývající se spektra. Síla v použití lifetime je obrovská a vy prozkoumáte mnoho lokalizačních i mikroenvironmentálních změn. Klíčové pak je, že STELLARIS shromáždí všechny tyto informace i z jediného detektoru a zbývající detektory nechá volné pro další fluorescenční barviva. Srovnání technologií je pak na obr. 9, kde je znázorněno jak jednoduše lze nadefinovat na 2 detektory až 4 fluorescenční lifetime kanály.

Obr%C3%A1zek9.png

Obr. 9  STELLARIS vs. tradiční konfokální mikroskopy bez lifetime

Co bude v dalším díle?

     V dalším díle se zaměříme na rychlost konfokálních systému, jednoduchost použití konfokálních systémů s Image Compas a LAS X Navigator. Na něco jsme zapomněli? Něco není dobře popsané, máte jakýkoliv dotaz, napište nám na mikroskopie@pragolab.cz.

Na něco jsme zapomněli? Něco není správně popsané? Máte jakýkoliv dotaz? Napište nám na: mikroskopie@pragolab.cz

Všechny starší články zde:

Seriál o STELLARIS systémech - 1. díl: Detekce 
Seriál o STELLARIS systémech - 2. díl: AOBS a Lasery

Reference

1. Iams H & Salzberg B: "The Secondary Emission Phototube" Proceedings of the IRE. 23: 55. (1935). doi:10.1109/JRPROC.1935.227243.
2.Hertz H:“ Ueber einen Einfluss des ultravioletten Lichtes auf die electrische Entladung“ In: Annalen der Physik und Chemie. 267, Nr. 8, 1887, S. 983–1000. ISSN 00033804. doi:10.1002/andp.18872670827
3.Einstein A: „Ueber einen  die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt“ In: Annalen der Physik. 322, Nr. 6, 1905, S. 132–148. ISSN 00033804. doi:10.1002/andp.19053220607
4.Rajchman J & Pike EW: "Electrostatic Focusing in Secondary Emission Multipliers" RCA Technical Report TR-362, September 9, 1937
5.Anzivino G et al. “Review of the hybrid photo diode tube (HPD) an advanced light detector for physics”. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A 365(1) (1995): 76
6.Borlinghaus RT: “Sensors and Measuring Techniques in Confocal Microscopy” Technological Reading, Leica Microsystems (2015).
7.Borlinghaus RT, Birk H and Schreiber F: „Detectors for Sensitive Detection: HyD“ Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology; Ed: Méndez-Vilas (2012)
8. Pawley J: “Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data”; Handbook of Biological Confocal Microscopy. Ed.: J. Pawley. 3rd edition. Springer US (2006)