Seriál o STELLARIS systémech - 2. díl: AOBS a Lasery
16. 3. 2021
V minulém
díle jsme pojednávali způsobu detekce a jaké detektory jsou možné pro nový
STELLARIS systém. V tomto díle se budeme věnovat akusticko optickému prvku
AOBS a laserům, které je možné připojit do systému.
Více
signálu = kvalitní výsledky
Přepracovaný
programovatelný krystal s názvem AOBS2 (Acousto Optical Beamsplitter) je výraznou inovací v celé konfokální hlavě. Tento
krystal řízený akustickým signálem je možné použít pro navázání speciálního pulzního
laserového bílého zdroje světla. Díky vlastnostem krystalu s přiloženým
akustickým signálem, lze uvnitř vytvořit takové vlastnosti, aby bylo možné přes
jeden tento prvek navázat několik laserových vlnových délek současně. Číselně vyjádřeno
je možné navázat až 8 vlnových délek. Optický krystal je vysoce transparentní, s
výjimečnými vlastnostmi i v emisní části, a to je pro získávání
emitovaného signálu kritická část. Na obr. 1 je uvedeno srovnání klasických
dichroických zrcadel s AOBS.
Obr. 1 – Srovnání
dichroických zrcadel a AOBS
Dichroická
zrcadla mají velkou mezeru v emisním spektru, díky nedokonalé výrobě
filtrů všeobecně. Díky větší mezeře je pak získávaný signál odfiltrován a tím
celkově snížen. U AOBS prvku jsou tyto mezery v emisním spektru opravdu
malé a signálu je pak více. Celkově pak lze použít nižších intenzit u použitých
laserů a tím snížit vysvěcování preparátů (photodamage, bleaching – nežádoucí
jev).
Z aplikačního
pohledu je pak výhodou použití AOBS možnost vyhnout se sekvenčnímu snímání
několika kanálů, včetně použití super-rezolučního modulu apod., eliminace cross-talk
neboli překryv fluorescenčního signálu z jednoho fluoroforu do druhého a
v neposlední řadě vyšší propustnost tohoto prvku než přes dichroická
zrcadla. Nový AOBS2 dokáže plně odfiltrovat i signál, který přichází přímo do
detektoru. Cross-talk lze v systému STELLARIS řešit opravdu mnoho způsoby.
STELLARIS umí hardwarové nastavit a oddělit spektra pomocí detektorů a jejich
konstrukci. Velkou novinkou jsou pak TauSENCE kontrasty, o kterých
budeme psát v dalším díle, který si nenechte ujít. Na obr. 2 jsou
zobrazeny živé HeLa buňky značené čtyřmi různými fluorofory k identifikaci
jader, aktinu, tubulinu a plazmatické membrány. Nastavením systému STELLARIS je
možné všechny 4 kanály nasnímat najednou s nastavením každého detektoru
specificky pro získání nejlepšího dynamického poměru.
Obr. 2 –
ukázka jednoduchého snímání bez použití sekvenčního snímání pro HeLa buňky a
čtyři fluorescenční značky najednou
Bílý
laser a další laserové zdroje
Vzhledem
k dnešním složitým výzkumným otázkám vědci potřebují systémy, které jsou velmi
intuitivní, spolehlivé, orientované pro široké spektrum použití. Systémy by
měli nabízet především jednoduché použití bez nutnosti znát dokonale všechny
vlastnosti zapojení systému apod. Výsledkem by měla být důležitá biologická či
jiná informace, která posune výzkum zase o krůček dál. Další vývoj směřuje
k vícebarevným experimentům, rychlejšímu snímání a vyšší flexibilitě systému.
Zpět
k laserovým zdrojům, těch může být celá řada. Jak jsou do tradičních
systému implementovány hraje velkou roli a velmi se řeší celková propustnost a
použití jednotlivých systémů. Diskrétní lasery omezují vaši flexibilitu při
výběru jednotlivých fluoroforů především z pohledu nepřesného nastavení
laseru do excitačního maxima daného fluoroforu. To znamená vyšší nastavenou
intenzitu laserů pro exctitaci fluoroforu a tím vyšší toxicita vzorků. Technologie
nové generace laseru s bílým světlem (WLL2), ve spojení s rodinou
detektorů Power HyD vám umožní optimálně zobrazovat prakticky jakýkoli
fluorofor v dostupném spektrálním rozsahu. Jaký je ten rozsah? Obrovský. Pro
systém STELLARIS 5 je možné použít pulzní bílý laser s rozsahem vlnových
délek od 485 až 685 nm, s možností volby jednotlivé vlnové délky po 1nm. U
systému STELLARIS 8 je potom bílý laser s rozsahem vlnových délek od 440
až 790 nm opět s možností volby po 1nm. Přičtěte si také možnost použití
klasických laserových zdrojů do systému. Tím se Vám nabízí obrovské možnosti
použití pro všechny konfokální aplikace. Sečteno a podtrženo STELLARIS 5 200
vl. délek a STELLARIS 8 až 350 vl. délek pro excitaci + klasické
laserové zdroje uvedené na obr. 3. Zajímá Vás životnost bílého laseru? Bílý
laser je vyvíjen ve spolupráci s firmou NKT, některé dlouhodobé testy
uvádí více jak desítky tisíc hodin. Výkon bílého laseru postačí na 99 %
aplikací, výkon je definován na jednotlivé laserové čáry a tím se opět otvírají
další možnosti v použití pro FRAP experimenty apod.
Obr. 3 –
Možnost použití laserových zdrojů pro systémy STELLARIS
Oblast
NIR s bílým laserem až do 850nm
Většina
konvenčních konfokálních systémů je vybavena pouze jednou nebo dvěma
samostatnými laserovými linkami v červené NIR oblasti. Kromě toho konvenční
GaAsP detektory nejsou dostatečně citlivé v rozsahu pro NIR oblast. Oba tyto
faktory výrazně omezují počet červených barviv, které lze zobrazit
v jediném experimentu. Trend poslední doby ukazuje posun do NIR oblasti,
kde jsou barviva stabilnější a méně náchylná na phototoxicitu. Ukázka na obr. 4
s buňkami Cos-7 značené červeně excitovatelnými sondami specifické pro aktin,
mitochondriální vnější membránu a tubulin. Tradiční konfokální mikroskopie s
detektorem GaAsP detekuje pouze SiRActin. Při použití rozšířeného WLL2 na
STELLARIS 8 společně s detektorem HyD R je tedy možné snímat i
v oblasti NIR až do 850 nm!
Obr. 4 –
aplikační ukázka pro fluorescenční značení do NIR oblasti
Kde
se lasery připojují?
Připojení
laserů ve skenovací hlavě je uvedeno na obr. 5, který jste již mohli vidět
v předchozím díle seriálu o STELLARIS. Důležitá část pro tento díl je připojení
laserových zdrojů v pravé části obrázku. Řízení laserů je po většinou
řízeno přes AOTF (Aukusticko optický laditelný filtr), který ovládána nastavení
intenzity pro použitý laser či DMOD (direct modulace). Pro systémy s MP
laserem je to potom AOM (akusticko optický modulátor). Jaký laser použít závisí
na aplikaci. Pokud nevíte, jaký typ laseru byste měli použít, prosím, napište
nám, rádi Vám pomůžeme.
Obr. 5 – skenovací
jednotka systému STELLARIS8
Co
bude v dalším díle?
V dalším
díle se zaměříme na technologii detektorů Power HyD S, R, X a
novinku pro systémy STELLARIS TauSENSE. Ukážeme si také, jak flexibilní
a jednouchý může systém STELLARIS být.
Na něco jsme zapomněli? Něco není správně popsané? Máte jakýkoliv dotaz? Napište nám na: mikroskopie@pragolab.cz
Seriál o STELLARIS systémech - 3. díl: Detektory v detailu a STELLARIS TauSENSE technologieNenechte si ujít další zajímavosti
- Thermo Scientific Stellar - revoluční hmotnostní spektrometr
- Představujeme: Revoluční platforma iontových chromatografů Thermo Scientific™ Dionex™ Inuvion™ z pohledu aplikací!
- Thermo Scientific Dionex Inuvion – nová úchvatná platforma iontových chromatografů
- UVIDĚT ZNAMENÁ UVĚŘIT – NOVÁ PŘIDANÁ INFORMACE K VÝSLEDKŮM TERMICKÉ A MECHANICKÉ ANALÝZY
- Analýza neutrálních i iontových PFAS v ovzduší pomocí termické desorpce ve spojení s plynovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií (TD-GC-MS/MS).