LC-MS okénko: Necílené metabolické profilovaní buněk ústního karcinomu pomocí spojení vysokotlaké iontové chromatografie a hmotnostního spektrometru o vysokém rozlišení (HPIC-HRAM).

11.03.2018

Kvalitní a reprodukovatelná analýza metabolitů vyžaduje nehledě na jejich fyzikálně-chemické vlastností vždy spolehlivou a robustní analytickou instrumentaci. Velké množství sledovaných analytů jsou malé a polární molekuly, na které mohou být nejrozšířenější chromatografické přístupy nedostačující.

Chromatografie na reversní fázi (RPLC) trpí v takovém případě nízkou selektivitou a opakovatelností. Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) vykazuje, navzdory polární stacionární fázi, nízkou opakovatelností retenčních časů. Další alternativou je okrajově rozšířená kapilární elektroforéza (CE). Kromě nízké selektivity a opakovatelnosti je však CE z důvodů použití pufrů zcela nevhodná pro spojení s hmotnostním detektorem (výjimkou je ZipChip technologie – kapilární elektroforéza na chipu implementovaná do iontového zdroje). Plynová chromatografie (GC) je z analytického hlediska ideální, avšak vyžaduje složitou přípravu vzorku ve formě derivatizace.

Vysokotlaká iontová chromatografie (Thermo Scientific Dionex ICS-4000 Caplillary High-Pressure Ion Chromatography HPIC ) s průtoky v rozmezí 5-30 µ l/min ve spojení s hybridním hmostnostním spektrometrem ( Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer ) operujícíim v režimu vysokého rozlišení (High-Resolution Accurate-Mass, HRAM) je v takovém případě volbou číslo jedna. Vynikající selektivita otvírá dveře skvělým separačním vlastnostem.  HPIC navíc přivádí z principu fungování vzorky do iontového zdroje již v ionizované formě. Eluent, KOH, je systémem automatické suprese převeden na čistou vodu, čímž je potlačena nežádoucí interakce korozivního KOH v iontovém zdroji hmotnostního spektrometru (Obr.1). 

Obr. 1: Schéma HPIC-HRAM instrumentace. Regenerace suppressoru je realizována externě za použití AXP pumpy. Tok za chromatografickou separací je obohacen o metanol s přídavkem 2mM kyseliny octové z důvodu podpoření ionizace v iontovém zdroji.

Obr. 1 – Schéma HPIC-HRAM instrumentace. Regenerace suppressoru je realizována externě za použití AXP pumpy. Tok za chromatografickou separací je obohacen o metanol s přídavkem 2mM kyseliny octové z důvodu podpoření ionizace v iontovém zdroji.

V prezentované srovnávací studii bylo nejprve analyzováno 42 standardů polárních metabolitů, z nichž 21 vykazuje problematické stanovení. Právě jejich komparativní analýza byla následně provedena za pomocí HPIC-HRAM, HILIC-HRAM a RP-UHPLC-HRAM. Výsledky na hladinách 600 ppb a 60 ppt pro IC-HRAM a 600 ppb pro HILIC-HRAM jsou uvedeny níže. RP-UHPLC-HRAM není z důvodu neuspokojivého stanovení uvedena (Obr.2).

Obr. 2: Výsledky stanovení standardů 21 polárních metabolitů na hladinách 600 ppb a 60 ppt za použití HPIC-HRAM instrumentace (vlevo a uprostřed) a na hladině 600 ppb za použití HILIC-HRAM (vpravo).

Obr. 2 – Výsledky stanovení standardů 21 polárních metabolitů na hladinách 600 ppb a 60 ppt za použití HPIC-HRAM instrumentace (vlevo a uprostřed) a na hladině 600 ppb za použití HILIC-HRAM (vpravo).

V druhém kroku bylo komparativně provedeno metabolické profilování buněčného lyzátu buněk ústního karcinomu (Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC). Z 66 identifikovaných metabolitů, 65 bylo stanoveno za použití HPIC-HRAM, 38 pomocí HILIC-HRAM a 29 pomocí RP-UHPLC-HRAM. Stanovení 26 metabolitů se překrývalo skrze všechny 3 instrumentální přístupy (Obr.3). 

Obr. 3: Překryv celkového množství stanovených metabolitů v závislosti na použité instrumentální metodě.

Obr. 3 – Překryv celkového množství stanovených metabolitů v závislosti na použité instrumentální metodě.

Separační síla a isomerní selektivita HPIC byla prokázána v případě separace 11 isomerů cukerných mono fosfátů, vykazující m/z 259.0224 (Obr.4).

Obr. 4: Separace 11 isomerních forem cukerných mono fosfátů (m/z=259.0224) za použití HPIC (A), RP-UHPLC (B) a HILIC (C).

Obr. 4 – Separace 11 isomerních forem cukerných mono fosfátů (m/z=259.0224) za použití HPIC (A), RP-UHPLC (B) a HILIC (C).

Více informací nelznete zde .