Nová éra hmotnostní spektrometrie

Molekulární biologie a biofarmaceutický průmysl dnes stojí před nebývalými nároky na analytické technologie. V éře omics přístupů – genomiky, proteomiky, metabolomiky či lipidomiky – už nestačí analyzovat jeden protein nebo jedinou metabolickou dráhu. Je třeba zmapovat celé sítě molekul a pochopit jejich funkci v kontextu buněk, tkání i celého organismu. Takový úkol vyžaduje nástroje s mimořádným výkonem, a proto se hmotnostní spektrometrie stala klíčovým pilířem moderní bioanalýzy. Její další rozvoj je přitom tlačen šesti zásadními oblastmi: separací, která musí zvládnout extrémně komplexní směsi; ionizací, jež určuje, co se vůbec dostane do detektoru; fragmentací, nezbytnou pro čtení molekulární struktury; dynamickým rozsahem, který rozhoduje o tom, zda v záplavě dominantních signálů nezaniknou nízko zastoupené látky; rychlostí, nutnou pro komplexní zmapování vzorku; a konečně rozlišením, které dovoluje odlišit i velmi blízké chemické entity.

Právě v proteomice se ukazuje, jak zásadní je posun v těchto parametrech. Zatímco identifikace proteinů je dnes rutinní, klíčovým úkolem je jejich kvantifikace napříč mnoha vzorky. K tomu se využívá metoda Tandem Mass Tag (TMT), při níž jsou peptidy označeny izobarickými značkami. Díky tomu je možné analyzovat více vzorků současně a přitom je od sebe spolehlivě odlišit v MS spektru. Nejnovější sada TMTpro 35-plex umožňuje sloučit až 35 biologických podmínek do jediné analýzy – což dramaticky zvyšuje statistickou sílu experimentů a šetří čas i náklady. Cena za tuto efektivitu je však vysoká: jednotlivé TMT kanály se liší o pouhé tisíciny jednotky m/z, takže bez velmi vysokého hmotnostního rozlišení by kvantifikace nebyla možná. Právě zde se ukazuje, proč jsou nové generace hmotnostních spektrometrů s rozlišením přesahujícím 100 000 FWHM nejen technologickými perlami, ale nutností pro seriózní proteomický výzkum.

Rozvoj hmotnostní spektrometrie lze v posledních letech sledovat zejména ve čtyřech instrumentálních kategoriích. (A) Kvadrupól + orbitální past (Orbitrap) – tato kombinace se stala zlatým standardem pro vysoce přesná měření, jak ukazuje úspěch řady Orbitrap Exploris. (B) Kvadrupól + lineární iontová past představuje flexibilní nástroj pro rutinní i pokročilejší aplikace, kde se cení robustnost a rychlost. (C) Kvadrupól + lineární iontová past + orbitální past (tzv. tribridy, např. Orbitrap Eclipse nebo Orbitrap Ascend) spojují výhody všech tří analyzátorů a nabízejí nejvyšší univerzálnost – od rychlého screeningu až po detailní strukturální studia. A konečně (D) Kvadrupól + orbitální past + TOF je kategorií, která přináší zcela nový rozměr. Díky dvěma vysokorozlišujícím analyzátorům – Orbitrapu a multireflexnímu time-of-flight (TOF) – lze dosáhnout paralelizace měření: Orbitrap poskytuje excelentní rozlišení a hmotnostní přesnost, zatímco TOF nabízí extrémní rychlost sběru dat. Tato kombinace otevírá cestu k experimentům, které by byly ještě před pár lety technicky nepředstavitelné – a právě sem směřuje vývoj nejnovějších přístrojů.

Do kategorie D patří zástupce nové generace: Orbitrap Astral. Tento přístroj spojuje kvadrupól s dvojicí vysokorozlišujících hmotnostních analyzátorů – Orbitrapem a TOF Astral analyzátorem (ASymmetric TRAck Lossless analyzer). Zatímco Orbitrap exceluje v rozlišení a přesnosti, Astral přidává extrémní rychlost akvizice, čímž vzniká kombinace ideální pro rozsáhlé proteomické experimenty. Standardní Astral zvládal akviziční rychlosti kolem 200 Hz, což samo o sobě znamenalo revoluci.

Na tuto platformu nyní navazuje Orbitrap Astral Zoom, který dále posouvá hranice. Uvnitř přibyly klíčové inovace: rychlejší iontový filtr a vysokorychlostní kvadrupól umožňující přepínat mezi izolačními okny s minimální ztrátou času; Bent Trap pro pre-akumulaci iontů, který zvyšuje duty cycle a využití iontového balíčku až o 40 %; a vylepšený ion routing multipole, který dovoluje rychlejší stepped collision energy experimenty. Díky těmto úpravám se Zoom dostává na rychlost akvizice až 270 Hz – tedy o více než třetinu rychleji než původní Astral. Navíc nabízí nové režimy: TMT High Resolution mode, který umožňuje spolehlivě kvantifikovat až 35 multiplexovaných vzorků, low-input mode pro analýzu vzorků o velikosti jednotlivých buněk a rozšířený Enhanced Dynamic Range (eDR) mode.

Dohromady tak Orbitrap Astral Zoom nepředstavuje jen upgrade, ale spíše zcela novou třídu přístroje, kde se rychlost TOF analyzátoru a preciznost Orbitrapu propojují do jedné platformy – a to bez kompromisů na straně citlivosti nebo spolehlivosti.

Orbitrap Astral Zoom dnes představuje absolutní špičku hmotnostní spektrometrie a posouvá hranice moderní vědy, zatímco Orbitrap Excedion Pro staví na excelentní citlivosti a spolehlivosti kvadrupól-Orbitrap hybridů. Excedion vychází z platformy Exploris 480, dlouhodobě považované za robustní „workhorse“ proteomických laboratoří, avšak přidává řadu zásadních inovací. Tou nejviditelnější je Bent Trap pro pre-akumulaci iontů, která umožňuje téměř 100% duty cycle. Výsledkem jsou spektra s vyšším signal-to-noise poměrem i v rychlých MS2 akvizicích a možnost měření při 70 Hz.

Další klíčovou novinkou je Enhanced Dynamic Range (eDR), při němž se pořizují multiplexované MS1 subscany s rozdílnými časy akumulace. Tento přístup zajišťuje, že i nízkoabundantní ionty získají dostatečnou intenzitu signálu, a umožňuje tak sledovat složky vzorku napříč pěti řády koncentrace. Excedion navíc disponuje volitelným EASY-ETD zdrojem, který umožňuje elektron-transferovou fragmentaci. V kombinaci s HCD vzniká EThcD, poskytující bohatší fragmentační spektra a usnadňující mapování posttranslačních modifikací, například disulfidových můstků.

Vylepšení se dotkla i iontové optiky: nový Electrodynamic Ion Funnel (EDIF) zajišťuje šetrný přenos labilních molekul a minimalizuje nechtěnou fragmentaci už na vstupu. Přístroj je také připraven na Hybrid-DIA workflow, které v sobě kombinuje přesně cílené PRM s DIA, čímž propojuje svět „známého“ a „neznámého“ v jediné analýze. Speciální edice Excedion Pro BioPharma pak rozšiřuje hmotnostní rozsah až do m/z 12 000, což umožňuje detailní studium intaktních proteinů a vyšších řádů proteinových komplexů.

Ve srovnání s Explorisem 480 tak Excedion Pro nepředstavuje jen modernizovanou verzi, ale spíše novou generaci kvadrupól-Orbitrap hybridů – přístroj, který si zachovává kompaktní formát a uživatelskou přívětivost, avšak nabízí výrazně vyšší citlivost, flexibilitu a metodickou univerzálnost pro biofarmacii, proteomiku i metabolomiku.

Orbitrap Astral Zoom a Orbitrap Excedion Pro ukazují dvě tváře nové éry hmotnostní spektrometrie: přístroje překonávají hranice rychlosti a multiplexingu, posouvají citlivost a kvantitativní přesnost na úroveň, o které jsme ještě nedávno jen snili. Společně tak tvoří arzenál, který otevírá vědcům i biofarmaceutickému průmyslu možnosti, jaké tu ještě nebyly – od single-cell proteomiky až po detailní charakterizaci složitých proteinových léčiv.

Za touto technologií stojí Thermo Fisher Scientific, světový lídr v oboru, a v českém prostředí ji přináší společnost Pragolab s.r.o.. Ta dodává nejen špičkové přístroje, ale i jistotu, že věda se dá dělat efektivně, spolehlivě – a s trochou nadhledu, který je v laboratoři někdy stejně důležitý jako vysoké rozlišení.

Pro více informací nás neváhejte kontaktovat na placek@pragolab.cz, hajek@pragolab.cz nebo eliasova@pragolab.cz.