LC-MS okénko: Online SPE-UHPLC-HRMS analýza směsi terapeutických proteinů

12.12.2017

Oddělení netěkavých solí, pufrů a dalších složek analytu schopných interagovat se stacionární fází chromatografické kolony a/nebo potlačovat ionizaci v iontovém zdroji hmotnostního spektrometru je z hlediska kvalitních a relevantních výsledků kruciální. Příprava, nejčastěji pak koncentrace a extrakce analytu na pevné fázi (solid phase extraction, SPE), je proto dnes v LC-MS laboratořích analyzující vzorky ve složitých matricích rutinní záležitostí. Její manuální provedení však není zcela efektivní a může být zdrojem kontaminace a velké odchylky v rámci opakovatelnosti.

Prezentovaná aplikace zahrnuje automatizaci tohoto procesu v rámci UHPLC-HRMS analýzy směsi 5-ti terapeutických proteinů upravených pomocí 0.1% kyseliny mravenčí (Formic acid, FA) na výslednou koncentraci 60 µ g/ml (tab .1).

Tab. 1 – složení analyzované směsi terapeutických proteinů včetně počáteční koncentrace a složení stabilizačního pufru.


Protein  Počáteční koncentrace  Stabilizační pufr 
rituximab 10 mg/ml
polysorbát (0.7 mg/ml), citrát sodný (7.35 mg/ml), NaCl (9 mg/ml), NaOH/HCl 
alpha-lactalbumin
1 mg/ml   0.1% FA  
cytochrom c   1 mg/ml   0.1% FA  
myoglobin   1 mg/ml   0.1% FA  
ribonukleáza A   1 mg/ml   0.1% FA  

Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s dodatečným 2-cestným 6-porotvým ventilem v kolonovém kompartmentu a kvarterní nízkotlakou pumpou (LPG) pumpou pro dávkování vzorku je předřazeno Thermo Scientific Q Exactive HF Hybrid Quadrupole Orbitrap hmotnostnímu spektrometru (MS).

LPG pumpa dávkuje isokraticky (0.1% TFA ve vodě, 300 µl/min) vzorek skrze ventil na trap kolonu (MSPac™ DS-10 Desalting Cartdridge) po dobu 2 minut. Následně dojde k přepnutí ventilu do eluční pozice a binární vysokotlaká gradientová pumpa (HPG) přivádí gradientem mobilní fázi (0.1% FA ve směsi voda/acetonitril, 100 µl/min) v opačném směru skrze trap kolonu a analytickou MAbPac™ RP kolonu na VWD detektor (variable wavelenght detector) a následně do hmotnostního spektrometru (Obr. 1)

Obr. 1: Instrumentální sestavení UHPLC s detailem ventilu

Obr. 1 – Instrumentální sestavení UHPLC s detailem ventilu(1), konfigurace ventilu pro dávkovací a eluční fázi (2) a profily mobilní fáze pro dávkovací a eluční pumpu (3) použité při online SPE-UHPLC-HRMS analýze.

Automatická příprava vzorku včetně samotné analytické metody trvá méně než 40 minut a zahrnuje 5ti minutovou ekvilibraci trap kolony. Použití HPG pumpy zajišťuje velmi rychlou separaci a díky spojení s vysoce přesným MS operujícím ve FullScan módů je možná determinace monoisotopické hmotnosti všech komponent s přesností pod 5 ppm. Total ion Current (TIC) spektrum společně s MS spektry každého ze sledovaných analytů a detaily SPE-UHPLC-HRMS analýzy jsou uvedeny níže (obr.2, tab. 2).

Obr. 1: Instrumentální sestavení UHPLC s detailem ventilu

Obr. 2 – Total Ion Current (TIC) společně s extrahovanými iontovými chromatogramy pro 5 analyzovaných terapeutických proteinů.

Tab. 2 – Detailní výsledky SPE-UHPLC-HRMS analýzy pro jednotlivé stanovované terapeutické proteiny a jejich glykované varianty.


Protein   Rt [min]   Teoretická MW [Da]   Experimentální MW [Da]   Přesnost hmoty [ppm]   Průměrný počet skenů na spektrum   Rozlišen 
Ribonukleáza (hovězí)   6.98   13673.260   13673.236   1.76   87   120 000  
Cytochrom c (hovězí)   8.88   12222.200   12222.180   1.64
87   120 000  
Rituximab + 2 G0F glykany   11.06   147074.600   147074.630   -0.14   15   15 000  
Rituximab + G0F/G1F glykany   11.06
147236.740   147237.310   -3.81   15   15 000  
Rituximab + G0F/G2F nebo (G1F)2 glykany   11.06   147398.890   147398.170   4.89   15   15 000  
Rituximab + G1F/G2F glykany   11.06   147561.030   147560.970   0.41    15 15 000  
Myoglobin (koňský)   11.65 16940.960   16940.956   0.24   87   120 000  
α-laktalbumin A (hovězí)   11.65 14168.747   14168.728   1.36   87   120 000  

Pro více informací: Technical Note72161-EN 0217S