Leica THUNDER

Widefieldové snímání; rychle, snadno a brilantně

Obr_1.jpg

Widefield fluorescenční mikroskopy jsou silným pomocníkem i pro mnohá pokročilá pozorování. Díky své rychlosti a citlivosti stále účinně doplňují pokročilé konfokální systémy. Značnou roli v jejich nasazení rovněž hraje i příznivější cena a mnohdy jednodušší ovládání. Na rozdíl od konfokálních mikroskopů, které snímají pouze rovinu zaostření, detekují konvenční fluorescenční mikroskopy signál i z oblastí nad a pod rovinou ostrosti. Proti rychlosti a citlivosti těchto systémů se tak staví snížená kvalita obrazu, obzvláště u silnějších vzorků, kde se signál jednotlivých struktur mimo rovinu obrazu slévá ve všudypřítomný opar (blur).

Obr.1: Mozková tkáň s YFP značenými neurony. Zamlžení efektivně zakrývá důležité detaily vzorku

Výsledný obraz je možno upravit dekonvolučními algoritmy aplikovanými na surová data. Ty pak pomáhají PSF (point spread function- rozptylová funkce.) „stlačit“ zpět do teoretického výchozího bodu. Bohužel, tyto procesy jsou výpočetně velmi náročné a jejich zpracování se může i při nasazení velmi výkonných počítačů protáhnout až na dny. To platí především u velkých datových objemů, které jsou produkovány například u 3D časosběrných snímků.

Obr_2.jpg

Blýská se na lepší časy?

Leica Microsystems v loňském roce představila technologii, která zásadně pozměnila možnosti v zobrazování objemných vzorků klasickým fluorescenčním mikroskopem. Jedná se o sérii zobrazovacích zařízení THUNDER. Skládá se z nejpokročilejších modelů mikroskopů podpořených algoritmem pro digitální clearing vzorku. A právě digitální clearing tvoří jádro této nové technologie.  Pro dokonalý výsledek jsou nové systémy THUNDER podpořeny možností adaptivní dekonvoluce převzaté ze super-rezolučního modulu Lightning pro konfokální mikroskopy Leica TCS SP8. Digitální clearing totiž nijak neupravuje PSF zaostřených struktur. Ty pak můžete vylepšovat pomocí výše uvedených dekonvolučních algoritmů.

  Obr. 2: Tentýž vzorek nasnímaný na THUNDER systému

Za vzpřímené mikroskopy zastupují sérii THUNDER modely Leica DM4 a DM6, za invertované mikroskopy platforma Leica DMi8 a za stereomikroskopy Leica M205 FA a FCA. Díky tomu je možno využít síly digitálního clearingu pro velmi široké spektrum vzorků. Od subbuněčných struktur až po celé organismy.

Obr3b.jpgObr3C.jpg    Obr3.jpg

  Obr. 3: Série THUNDER je založena na vlajkových lodích jednotlivých řad mikroskopů Leica Microsystems

Jak to funguje?

V našem labletteru a ZDE naleznete odkaz na velmi podrobný technologický popis celé technologie THUNDER. Pro tento článek jsme zvolili velmi stručný souhrn. K podrobnému popisu technologických a matematických detailů, nejlépe poslouží přiložený technologický list.  Technologický list ke stažení zde!  Dle typu použitého dekonvolučního parametru je možné na vzorek aplikovat tři základní postupy.

Instant computational clearing (ICC) 

Obr%20a.png

Zde se jedná o čistý clearing bez použití dekonvolučního algoritmu. Souhrnně lze říci, že THUNDER dokáže dle typu PSF rozeznat, zda se jedná o signál z dané optické roviny, či jde pouze o rozostřený signál ze struktur nad, či pod rovinou ostrosti. Takový signál je pak separován a není do finálního obrazu zahrnut. Toho, co se na první pohled může zdát jednoduché, je dosaženo díky robustnímu algoritmu, zpětné vazbě z optického systému do softwaru a také díky velmi silným výpočetním stanicím, které se o chod Leica THUNDER systémů starají. Důležitou předností této metody je uchování původní PSF ze struktur v dané rovině ze struktur v dané rovině

      

Small Volme computational clearing (SVCC) a Large Volume Computational Clearing (LVCC)

obr%20c.pngobr%20b.png

Po vyčištění obrazu pomocí CC se navíc aplikuje adaptivní dekonvoluce dedikovaná pro zpracování tenkých nebo naopak vrstevnatých vzorků. Ta detekuje lokální poměr signálu a šumu pro správné nastavení parametrů dekonvoluce, a to separátně pro každý Voxel zvlášť. (Voxel = pixel v trojrozměrné mřížce dat.) Tento proces probíhá automaticky a nevyžaduje žádné zadávání hodnot uživatelem. 

Pouze software?

Stávající techniky vylepšení widefieldového snímání na hardwarovém základu sebou přinášejí řadu nevýhod, jako jsou ztráta rychlosti, citlivosti a zvýšený výskyt artefaktů. Technologie, které by tyto nevýhody neměly a zároveň by měnily způsob samotného získávání surového signálu, se však zatím pro běžné uživatele na obzoru neobjevují. Digitální clearing pracující s konvenčním fluorescenčním obrazem s sebou přináší řadu nepopiratelných výhod. Nejvýraznějším benefitem je vysoká rychlost a citlivost. Jelikož není pro získání snímků přidávat do optické trasy další prvky, nebo pořizovat pro výsledný efekt více snímků, neztrácí systémy THUNDER proti klasickým mikroskopům na rychlosti a jsou velmi odolné proti případným artefaktům vznikajícím pohybem a změnou intenzity při delších expozicích. Jsou tak výbornou volbou i pro live-cell imaging a to jak na úrovni jednotlivých buněk, tak i na úrovni 3D buněčných kultur, jako jsou buňky ve 3D nosičích, sféroidy a organoidy. U 3D buněčných kultur se výhody digitálního clearingu projeví v plné míře.

  Obr4.jpg

Obr 4: migrující C2C12 buňky nasnímané invertovaným THUNDER Imagerem pro 3D Live Cell. Fialově jsou značené jaderné struktury (lamin B), modře DNA (Hoechst) a žlutě poškození DNA (γH2AX). Snímek je složený z jednotlivých rovin. Výsledkem je snímek o 17,47 µm hloubce ostrosti.

Další předností těchto systémů je uchování citlivosti snímání. I když je celkový signál o něco slabší v důsledku separace signálu pozadí, signál vystupující z jednotlivých struktur si uchovává svůj původní jas.
Benefitem je jednoduchost používání těchto systémů. Od konvenčního snímání se liší pouze ve výběru preferované metody a zadání kultivačního média, přesněji jeho refrakčního indexu. To je jediná hodnota z celé optické trasy, kterou tyto mikroskopické systémy neznají.
Leica THUNDER nabízí pro pokročilé uživatele zvyklé na plnou kontrolu systému mód, kde je možné mnoho parametrů dekonvoluce tak i samotného clearingu nastavit manuálně. Navíc není nutné po celou dobu zpracování opouštět příjemné uživatelské rozhraní ovládacího programu a data složitě zpracovávat přes externí software, který by výsledný obraz zpracoval.

Obr5.png

  Obr. 5: Ovládací panel THUNDER. Po výběru požadované metody stačí pouze zadat refraktivní index vzorku a můžete snímat. Pokročilá nastavení pak rozevřou nabídku pro manuální nastavení, kde lze ovlivnit značné množství parametrů a dig. clearingu

Je dobré zmínit, že všechny snímky nasnímané na systému THUNDER jsou provázané s potřebnými metadaty nesoucími informace nutné k provedení optického clearingu. Optický clearing vzorku je tedy možné provést i po nasnímání. Nicméně rychlost celého procesu je taková, že při aktivaci probíhá v reálném čase a clearing je aplikovatelný i na živý náhled vzorku! Tato vlastnost předurčuje využití digitálního clearingu především v simultánním módu již při snímání Vašich dat.
THUNDER systémy však vždy uchovávají rovněž surová widefield data a Vy je tak budete mít po ruce pro potřeby srovnání, kvantifikace nebo aplikace odlišných parametrů pro optický clearing.

Ušetřete čas

Obrazová kvalita snímků z THUNDER systémů vám umožní přenést mnohé aplikace z věčně vytížených konfokálních systému na konvenční fluorescenční mikroskopy.
U vzorků, které konfokální mikroskopii i přesto vyžadují, pak THUNDER systémy v součinnosti s modulem LAS X NAVIGATOR tvoří ojedinělý odrazový můstek pro přípravu snímaní na konfokálních mikroskopech. Vytvoříte snadno přehledový snímek o vysoké kvalitě bez přirozeného zamlžení a lehce definujete oblasti zájmu. Následně stačí přenést vzorek, nahrát soubor do konfokálního mikroskopu a spustit finální skenování. Výrazně tak zkrátíte a zefektivníte čas strávený na konfokálních mikroskopech v těsných a zpoplatněných časových oknech, jak tomu u těchto systémů často bývá.

Obr6%20a.png

Obr. 6 : V kombinaci s LASX navigator můžete využít THUNDER systémy pro vytváření přehledových snímků a určení souřadnic pro konfokální systémy

Na vlastní oči

Co říct závěrem? Vliv výpočetní techniky prostupuje každým oborem lidské činnosti. U mikroskopického snímání je tomu již dlouho a systémy Leica THUNDER přináší další výrazný pokrok v možnostech a uživatelské přívětivosti widefieldového snímání. Po překonání přirozeného ostychu před novými technologiemi na Vás čekají nové obzory možností mikroskopie. Jestliže budete mít možnost vyzkoušet THUNDER systémy přímo na Vašich vzorcích, neváhejte ani vteřinu a přesvědčte se osobně, nebo se nechte inspirovat v naší galerii.

Video od produktové manažerky


Produktová manažerka Jennifer Kulhei Vás provede celým procesem snímání na systému THUNDER imager 3D Tissue od vložení vzorku až po automatickou obrazovou analýzu. 

Nadcházející akce s Leica THUNDER systémy

Podpis_Thunderroadshow_high.jpg
Pro více informací nás kontaktujte na adrese mikroskopie@pragolab.cz 

Tým mikroskopie Pragolab

LinkedIn.pngFacebook.pngYoutube.png