Separace N-glykanů na nové vícemodální koloně GlycanPac AXR-1

3. 12. 2014
Glykany jsou definovány jako monosacharidy spojené glykosidickou vazbou. Glykany lze nejčastěji najít kovalentně navázané na proteinech jako glykoproteiny (obr. 1). Funkce glykoproteinů je často závislá na struktuře a typech glykanů. Glykany se dělí podle typu vazby na proteinu na N-glykany (vazba na amidový dusík z asparaginu) a O-glykany (vazba na hydroxylovou skupinu serinu nebo threoninu). Glykany mají funkci v širokém spektru biologických a fyziologických procesů, jako je rozpoznávání buněk a patogenů, regulace, buněčná komunikace, genová exprese, buněčná imunita a další. N-glykany jsou častým zájmem studia v oblasti terapeutických proteinů, protože většina z nich je glykosylována. Glykosylace je nejběžnější posttranslační modifikací proteinů. Struktura glykanů je velmi diverzní, komplexní a heterogenní. Porozumění struktuře glykanů (zastoupení monosacharidů, vazby, izomerie, náboj a velikost) poskytne detailní informace nezbytné pro vývoj a výrobu klinicky důležitých proteinů.

sep_01.jpg
Obr. 1: Glykoproteiny

K separacím glykanů bylo v minulosti použito více separačních módů, jako jsou normální fáze, hydrofilní interakce (HILIC), iontově výměnná nebo reverzní fáze. Glykany jsou velmi hydrofilní a polární, a proto nejběžnější typ kolon používaných pro separace glykanů jsou amidové HILIC kolony, příkladem je Thermo Scientific Accucore150-Amide-HILIC, která je vhodná pro separace 2AB-značených N-glykanů získaných z protilátek (většina z těchto glykanů nemá náboj). Tento typ kolony neseparuje glykany dle náboje (př. neutrální nebo sialylované glykany). Proto byla vyvinuta nová kolona Thermo ScientificTM GlycanPacTM AXR-1, která je vícemodální kolonou kombinující dva separační módy: aniont výměnná fáze (WAX-retence negativně nabitých glykanů) a reverzní fáze (RP-separace stejně nabitých glykanů podle jejich izomerie a velikosti). Kolona umožňuje separovat zároveň neutrální a nabité glykany za elučních podmínek vhodných pro detekci hmotnostní spektrometrií.

sep_02%20.jpg
Obr. 2: Separace 2AB-značených N-glykanů z hovězího fetuinu na koloně GlycanPac AXR-1

Můžeme srovnat separace 2AB-značených N-glykanů z hovězího fetuinu na koloně GlycanPac AXR-1 (obr. 2) a na koloně Amide-HILIC (obr. 3). Chromatografické podmínky byly zvoleny srovnatelné. Eluční profil glykanů separovaných na nové koloně GlycanPac AXR-1 je primárně založený na separaci podle náboje: nejprve jsou eluovány neutrální glykany, poté mono-, di-, tri-, tetra- a nakonec penta-sialylované glykany. Glykany v každé skupině jsou dále separovány podle své velikosti a izomerické struktury. V 73 píkách z kolony GlycanPac AXR-1 bylo identifikováno 135 glykanů a v 24 píkách získaných z kolony Amide-HILIC bylo identifikováno pouze 26 glykanů, protože glykany o různých nábojích nebyly separovány. Kolona GlycanPac AXR-1 nabízí separace glykanů s vysokým rozlišením dle náboje, izomerie a velikosti. Kolona umožňuje separace glykanů nativních i značených, nabitých i nenabitých a je kompatibilní s fluorescenční a MS detekcí. Tato vícemodální kolona je jedinečná svými vlastnostmi a pro separace glykanů je nenahraditelná.

sep_03.jpg
Obr.3: Separace 2AB-značených N-glykanů z hovězího fetuinu na koloně Amide-HILIC