LABORATORNÍ LYOFILIZACE NEJEN PŘI KONTROLE ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ

Snad nebude příliš troufalé tvrzení, že v dnešní době se už s lyofilizací setkal prakticky každý. Kde? Například s překvapivě chutným lyofilizovaným ovocem. Tato triviální zkušenost nesporně svědčí o faktu, že lyofilizace doznala za poslední roky velkého technického rozvoje a především dostupnosti. Cílem tohoto článku je ukázat, jakým může být lyofilizace přínosem v běžné laboratoři, a to i se zaměřením na analýzu a zpracování vzorků při monitoringu životního prostředí.

Základní benefity lyofilizace

Co je to lyofilizace? Jde především o techniku, která velmi precizně a šetrně zbavuje zpracovávaný materiál prakticky všech kapalných složek (nejčastěji vody, a proto tedy budeme dále uvádět už jen vodu) a při vhodném nastavení procesních parametrů dokonce i krystalicky vázanou vodu. Hlavním fyzikálním činitelem při lyofilizaci je sublimace vody po předchozím zamražení. V dnešní vyspělé instrumentaci je tento proces dále podpořen různými stupni vakua a IR zahříváním. Naprosto podstatné je, že k přeměně pevné fáze na fázi plynnou dochází, aniž by voda procházela přes fázi kapaliny, kdy by mohlo dojít k poškození nebo dokonce znehodnocení původního materiálu (vyšší teploty, rázovitá expanze vzniklých par apod.).

Během procesu lyofilizace může ztratit vysoušený materiál více než 99,9% veškeré původní vody, přičemž při vhodném nastavení procesních parametrů se jedná i o odstranění vody vázané – krystalové. Lyofilizace má několik zásadních benefitů. Prvním, který ji odlišuje od ostatních dehydratačních technik je, že dehydratace probíhá na zmrazeném, a tedy chemicky méně aktivním produktu. Druhým je přítomnost vakua, které minimalizuje účinky případné oxidace u materiálů senzitivních na působení vzdušného kyslíku. Třetí významný benefit přináší nízká teplota, která významným způsobem přispívá k potlačení případných termo-degradačních procesů v sušeném materiálu. Všechny tyto benefity přispívají k výrazně narůstající oblibě lyofilizace v mnoha laboratořích, které zpracovávají nestabilní a citlivé materiály zejména biologického nebo organického původu (vzorky zemin, tkání, enzymy, DNA apod.).

Nelze opomenout, že lyofilizované materiály si ve velké míře zachová-vají svou strukturu a po přidání vhodného množství rozpouštědla (obvykle vody) získají svou původní morfologii (například buněčné materiály apod.). Lyofilizace tak šetří materiál i před strukturními degradacemi. Nezřídka je nutné vzorky také archivovat a jelikož při lyofilizaci dojde k odstranění naprosté většiny vody, je pak vzorek dobře ošetřen proti mikrobiálnímu růstu a chemickému rozkladu. V řadě případů je také potřeba lyofilizovaný materiál dál analyzovat a jelikož led velmi dobře sublimuje, lze při vhodném nastavení para-metrů sublimace ostatní těkavé složky v původním materiálu z velké míry zachovat. S výhodou se tato skutečnost využívá nejen u potravin, ale také i u enviromentálních vzorků (půdy, kaly apod.).

Není bez zajímavosti, že výhody lyofilizace byly známé už ve starověku. Např. peruánští Inkové v Andách tak zvyšovali trvanlivost svých zásob potravin. Potraviny ukládali na vrcholky Machu Picchu, kde je nízká teplota zamrazila a nižší atmosférický tlak vedl vlastně k pomalému lyofilizačnímu procesu a odstranění vody z těchto potravin.

Aplikace lyofilizace

V současné době má lyofilizace velmi široké uplatnění. Dominantní postavení má stále potravinářský a farmaceutický výzkum, vývoj a průmysl. Je to dáno jednak historicky a dále pak i principiálními důvody – pracuje se prakticky bezvýhradně s chemicky a tepelně citlivými materiály. V neposlední řadě hrají roli i důvody čistě ekonomické, jako je potřeba prodloužení doby exspirace u potravin, léčiv apod.

Kromě těchto dvou dominantních oborů postupně přibývá využití lyofilizace i v dalších oborech, kde velmi efektivně pomáhá předpřipravit celou řadu vzorků pro další zpracování, analýzy a následně i archivaci. Příkladem jsou třeba různé vzorky v rámci kontrolního monitoringu životního prostředí nebo hydrogeologických studiích v krajině. Vzorky k monitoringu životního prostředí se odebírají ze vzduchu, vody, půdy a nesčetných sedimentů nebo z vegetace a z potravin. Současně rozvíjející se environmentální banka shromažďuje, uchovává a analyzuje ohromné množství reprezentativních vzorků. Takové vzorky jsou analyzovány na extrémně širokou škálu složek a je potřeba, aby se bylo možné v případě potřeby k analýzám vrátit nebo některé analýzy i doplnit. Lyofilizace se stává při přípravě těchto vzorků důležitým hráčem. Je nutné zdůraznit, že většina analytických metod je vhodná pouze pro zkoumání malých množství vzorků, i když jsou velmi často z terénu dostupné vzorky relativně velké. V mnoha případech se vyplatí lyofilizovat výchozí materiál a následně dílčím způsobem jej extrahovat pro elementární či jinou analýzu. Ke zbytku materiálu se pak lze kdykoliv opakovaně vrátit. Změny látek, které mají být stanoveny (např., těžké kovy, PCB, PAC a dioxiny), jsou takto minimalizovány. U mnoha vzorků z životního prostředí je také nutné stanovit obsah vody ve vzorku, který je dán rozdílem hmotnosti mezi čerstvou hmotou a sušinou (lyofilizovanou). Hmotnost sušiny se stanoví ze zbytku vzorku po někdy i několikadenní lyofilizaci. To současně, jak bylo řečeno už výše, umožňuje dlouhodobé skladování vysušených vzorků, aniž by došlo ke strukturní změně nebo ztrátě jiných, např. chemických vlastností vzorku.

Přibývá využití lyofilizace i v dalších oblastech jako je například restaurování starých knihtisků a obrazů poškozených vlhkostí (takto byly například ošetřovány vzácné knihy z pražských archivů postižené povodní v roce 2002). Je možné vyjmenovat mnoho dalších příkladů použití lyofilizace, které zahrnují tvorbu mikrobiálních a tkáňových databank, konzervace tkání a bakteriálních kultur apod.

V tab. 1 je uvedeno stručné shrnutí aktuálního aplikačního využití lyofilizace.

Tab. 1: Shrnutí aplikačních oblastí lyofilizace

Základní principy instrumentace

Instrumentace umožňující úspěšné provedení lyofilizace (v jakémkoliv měřítku) musí respektovat fázové stavy odstraňovaného rozpouštědla (vody). Na příkladu fázového digramu vody (obr. 1) je jasně patrné v jakých hodnotách teplot a tlaků je se možné pohybovat, aby nastala právě sublimace – tedy přechod mezi pevnou (led) a plynnou fází vody (rozpouštědla).

Obrázek 1: Fázový digram vody

Fázový digram vody (rozpouštědla) jednoznačně předurčuje tři základní lyofilizační kroky, které jsou schematicky vyznačeny písmeny A, B, C, D na obr. 1. Popis těchto tří lyofilizačních kroků (fází) je uveden v tab. 2.

Tabulka 2: Tři základní fáze lyofilizace

Je naprosto běžné, že dnešní lyofilizátory umožňují velmi precizně monitorovat tyto tři jednotlivé fáze lyozilizace s možností měnit fyzikální parametry zmíněných lyofilizačních kroků tak, aby se dosáhlo žádaného výsledku podle typu vzorku.

Příklad takového záznamu lyofilizačního procesu (lyofilizátor společnosti CHRIST) je uveden na obr. 2.

Obr. 2: Záznam fyzikálních hodnost během lyofilizace na zařízení CHRIST (Germany)

Příklady instrumentace (CHRIST)

V dnešní době je lyofilizace instrumentována stejně jako celá řada jiných fyzikálně-chemických technologických procesů do tří obvyklých měřítek:

Laboratorní měřítko
Pilotní měřítko
Výrobní měřítko

4.1 Laboratorní měřítko

Hlavním znakem laboratorního měřítka je práce s malým množstvím vzorků (jednotky g až dolní jednotky kg roztoků či suspenzí) s možností pohotových změn fyzikálních parametrů v průběhu vlastní lyofilizace. Je možné pracovat se všemi laboratorně obvyklými nádobami (baňky, petriho misky, vialky apod.). Tato zařízení jsou tedy velmi flexibilní. Laboratorní lyofilizátory se výborně hodí pro práci v oblasti základního výzkumu a všude tam, kde je potřeba spíše nahodile lyofilizovat velké množství různých typů menších vzorků. S výhodou tyto lyofilizátory používají vědečtí pracovníci základního výzku (chemici, biologové, mikrobiologové apod.) a čím dál častěji kontrolní státní či soukromé laboratoře zaměřené na životní prostředí. Na obr. 3 je uveden typický laboratorní lyofilizátor CHRIST.

Obr. 3: Laboratorní lyofilizátor Alpha 2-4 LSCbasic společnosti CHRIST (Německo)

4.2 Pilotní měřítko

Lyofilizátory pilotního měřítka zpracovávají středně velké množstvím vzorků (jednotky až desítky kg roztoků či suspenzí) s možností změn fyzikálních parametrů v průběhu vlastní lyofilizace. Většinou už ale pracují s vialkami, přičemž mohou být uzpůsobeny i na ostatní běžné nádoby jako lyofilizátory laboratorního měřítka (baňky, petriho misky apod.). Sledování fyzikálních parametrů lyofilizace je u pilotních lyofilizátorů sofistikovanější než u laboratorních a lze tak lépe optimalizovat lyofilizační proces pro případný přechod na výrobní měřítko. Není výjimkou též možnost měření teploty přímo v samotných vzorcích a sledovat tak jednotlivé fázové přechody probíhající v samotném lyofilizovaném materiálu.

V dnešní době lze toto řešit unikátním bezdrátovým systémem, např. WTMplus vyvinutý společností CHRIST. Obr. 5 znázorňuje bezdrátové teplotní čidlo umístěné do vialek. Výjimkou není též rozšíření i o možnost vážení vzorků (obr. 6) či dalších pomocných instrumentálních technik v podobě různých spektroskopických metod, které dále umožňují monitorovat děje ve zpracovávaném materiálu. Samozřejmostí také je, že pilotní stroje umožňují jít do většího rozsahu základních fyzikálních hodnot během lyofilizace (nižší teploty, hlubší vakuum) a jsou také lépe uzpůsobeny na práci i s nevodnými rozpouštědly. Jistě nepřekvapí i kvalifikace IQ/OQ a provedení do čistých prostor. Pilotní stroje jsou obvykle využívány ve výrobních podnicích pro účely malovýroby nebo optimalizace přechodu na velkou výrobu. Na obr. 4 je uveden typický pilotní lyofilizátor CHRIST.

4.3 Výrobní měřítko

Z důvodu zaměření tohoto článku budou výrobní lyofilizátory uvedeny okrajově. Výrobní lyofilizátory jsou již uzpůsobeny na opakované zpracovávání velkého množství vzorků (stovky kg roztoků či suspenzí). Nejčastěji pracují s velkým množstvím vialek (farmaceutické výroby), ale jelikož se vždy jedná o systémy stavěné na míru uživateli, lze pak lyofilizovat i z jiných nádob a formátů vzorků. V celku se vždy jedná o stavebnicový systém, kdy je myšleno i na případné budoucí změny. U výrobních lyofilizátorů jsou samozřejmostí veškeré další vlastnosti, které již měly lyofilizátory pilotní a taktéž soulad s dalšími standardy farmaceutických a potravinářských výrob a tedy i práce ve sterilním prostředí a návazné technologie umožňující pravidelnou sterilizaci vlastního zařízení. Jeden z možných výrobních lyofilizátorů společnosti CHRIST je zobrazen na obr. 7.

U výrobních lyofilizátorů společnosti CHRIST jsou též další rozšiřující technologie v podobě automatických podavačů vzorků apod. Ukázka výrobního lyofilizátoru s automatickým podáváním a odběrem vzorků je na obr. 8.

U všech lyofilizátorů společnosti CHRIST je standardem precisní řídící software. Jako příklad lze uvést software LPCplus SCADA System, který poskytuje uživatelsky přívětivé a intuitivní rozhraní pro řízení veškerých procesů a systémů lyofilizátorů. Též nad rámec tématu tohoto článku stojí za uvedení, že software LPCplus byl vyvinut v souladu s ustanoveními předpisu 21 CFR část 11 amerického úřadu pro kontrolu potravin a léčiv (FDA), pokud jde o data uložená v elektronické podobě a elektronické podpisy.

Závěr

Obliba lyofilizace má narůstající tendenci, a to díky globálně zvyšujícímu se tlaku na kontrolu stavu životního prostředí, na životnost a na efektivitu dalšího zpracování mnoha materiálů. Dnes už je pevným faktem, že své místo má lyofilizace ve farmacii a potravinářství. Ještě před nedávnem překvapivou, ale dnes již velmi častou oblastí, je i umění a zejména restaurace uměleckých předmětů. Ruku v ruce s rozvojem analytické chemie a nárustem legislativních požadavků lyofilizace pomáhá při předpřípravě a archivaci celé řady typů vzorků. Lyofilizace se také postupně stává neodmyslitelným pomocníkem zcela moderních disciplín, jako je nanotechnologie, kde například pomáhá připravovat a zachovávat nanostrukturní materiály.

Dobrou zprávou je, že zejména laboratorní lyofilizátory jsou i přes značnou technickou vyspělost finančně dostupné pro celou řadu běžných laboratoří různých velikostí. Do budoucna lze tedy očekávat, že se využití lyofilizace bude rozrůstat a možná bude jednou tento proces i součástí každodenního života nejen u odborné veřejnosti.

Literatura

[1] Veřejně dostupné a interní materiály společnosti Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH
[2] Nail, Steven L., et al. "Fundamentals of freeze-drying." Development and manufacture of protein pharmaceuticals (2002): 281-360.
[3] García, JL Luque, and MD Luque de Castro. „Acceleration and automation of solid sample treatment“. Elsevier, (2002).

Pro více informací kontaktujte Davida Petráše: petras@pragolab.cz.